Измерение анизотропии флуоресценции

В этой главе будут описаны основы теории стационарных измерений анизотропии флуоресценции и приведены избранные примеры применения метода в биохимии. В следующей главе мы рассмотрим теорию и применение кинетических измерений анизотропии флуоресценции. [c.122]

РИС. 5.1. Схема измерения анизотропии флуоресценции. [c.123]

Измерение анизотропии флуоресценции [c.136]

РИС. 5.8. Схематическая диаграмма измерения анизотропии флуоресценции однолучевым методом. [c.137]

РИС. 5.9. Схематическая диаграмма измерения анизотропии флуоресценции двух-лучевым методом. [c.140]

Принцип измерения поляризации флуоресценции или анизотропии иллюстрирует рис. 5.1. Образец возбуждается вертикально поляризованным светом, причем электрический вектор возбуждающего пучка ориентирован параллельно оси 2. Затем измеряется интенсивность испускания через поляри- [c.122]

Прежде чем продолжить дальнейшее обсуждение факторов, приводящих к деполяризации флуоресценции, полезно разобраться в методах, которые используют для измерения анизотропии или поляризации. Мы коснемся здесь стационарных измерений, но подобное изложение применимо и к кинетическим измерениям анизотропии. Обычно используют два метода однолучевой (L-формат), в котором используется один канал регистрации испускания, и двухлучевой (Т-формат), в котором параллельная и перпендикулярная составляющие наблюдаются одновременно в разных каналах. Каждый метод имеет свои преимущества. Методика, описанная ниже,. введена для корректировки различной чувствительности прибора при регистрации по-разному поляризованных составляющих испускания (гл. 2). [c.136]

Измерения анизотропии при изменении времени затухания флуоресценции [c.188]

Па пути возбуждающего и испускаемого световых потоков ставят поляризаторы. Чаще всего поляризаторы отодвинуты их вводят только для измерений анизотропии флуоресценции или когда необходимо выделить определенным образом поляризованную компоненту испускаемого и/ или возбуждающего света. Для точного измерения анизотропии флуоресцещии требуется расположение поляризаторов под определенным углом, поэтому оправы поляризаторов должны быть хорошо закреплены и тщательно проградуированы. Оптический модуль (рис 2.1) имеет дополнительный оптический путь с прапой стороны от держателя образца. С его помощью можно проводить измерения анизотропии флуоресценции двухканальным методом (гл. 5), более точным, чем одноканальный метод, в котором это1 дополнительный оптический канал ис требуется (разд. 5.4). [c.32]

Кроме того, при проведении "холостого" опыта можно обнаружить присутствие флуоресцирующих примесей. При исследовании контрольных образцов необходамо иметь в виду, что рассеянный свет полностью поляризойан. Важность этого фактора иллюстрирует рис. 2.7, на котором приведены спектры испускания NATA. Для увеличения интенсивности рассеянного света в опыте было добавлено небольшое количество гликогена. Спектры испуска- ния записаны при вертикальной и горизонтальной ориентации поляризатора испускания. Рассеянный возбуждающий свет хорошо заметен, когда поляризатор ориентирован вертикально. Напротив, почти никакого рассеянного света не наблюдается при ориентации поляризатора в горизонтальном направлении. Отсюда можно сделать несколько выводов. Предположим, что проводятся измерения анизотропии флуоресценции. Если спектры "холостых" проб рассматривают при горизонтальной ориентации поляризатора испускания, можно ошибочно заключить, что количество рассеянного света незначительно. При проведении измерений в присутствии рассеянного света лучше всего ставить оба поляризатора в вертикальное положение, чтобы можно было заметить, [c.41]

Измерение анизотропии флуоресценции широко используется в биохимических исследовшшях. Это происходит потому, что любые факторы, которые влияют на размер, форму и сегментальную гибкость макромолекулы, будут влиять на наблюдаемую анизотропию. Вышеперечисленпые свойства макромолекул могут изменяться под воздействием рП, температуры, вязкости, денатурирую1цих агентов и из-за реакций ассоциации. В следующих разделах будет приведен ряд результатов, которые иллюстрируют использование и интерпретацию измерений анизотропии. [c.149]

После этих начальных наблюдений измерения анизотропии флуоресценции стали широко использоваться для исследования динамики мембран. Некоторые благ оприятные характеристики метода, а именно относительно простая теоретическая основа, несложное и сравнительно недорогое оборудование и высокая чувствительность измерений, способствовали его широкому распространению. Благодаря высокой чувствительности появилась возможность проведения экспериментов в разбавленных суспензиях мембран, содержащих только следовые количества зондов. Типичное молярное соотношение липид/зонд находится в диапазоне 200 1 - 2000 1, а типичная концентрация липидов составляет 0,1-10 мг/мл. [c.151]

Измерение спектров и анизотропии флуоресценции в стационарном, импульсном и модуляционном режимах позволяет в настоящее время изучать широкий спектр структурных и динамических свойств молекулярных систем локализацию и доступность флуорофоров в макромолекулах, мембранах и других микрогетерогенных системах, их организацию и структуру, проницаемость, коэффициенты распределения и сегрегацию веществ в таких системах, микровязкость, вращательную диффузию и сегментальную подвижность, заторможенное и ограниченное вращение групп, процессы релаксации, димеризации, связывания, ассоциации и денатурации. Изучая релаксацию спектров и анизотропию флуоресценции, можно получить информацию о ближайшем окружении флуорофора (1-2 молекулярных слоя) изучая перенос энергии, тушение и реакции возбужденных молекул, можно зондировать уже больший объем вокруг флуорофора (до 10 нм). Как это сделать практически, можно научиться по книге Дж. Р. Лаковича. Конечно, данная область находится лишь в начале своего развития. Многие возможности пока ещё не реализованы, многие трудности и ограничения пока не до конца осозна11Ы, иногда появляется излишний оптимизм и делаются довольно смелые выводы. Со временем все эти трудности роста при широком применении флуоресцентных методов будут преодолены. Безусловно, можно надеяться, что именно флуоресцентные методы позволят получить более глубокую информацию о структуре и свойствах организованных молекулярных систем - как природных, так и синтетиче ских, - научиться управлять ими и создавать эффективные системы для преобразования солнечной энергии в химическую, записи и обработки информации, молекулярной электроники. [c.6]

Подстановка (5.18) в (5.19) дает соа20 = 3/5. С учетом уравнения (5.17) можно найти максимальную, анизотропию, равную 0,4. Это значение получается, когда диполи поглощения и испускания параллельны и нет других процессов, приводящих к деполяризации. Легко заметить, что это значение (0,4) гораздо меньше, чем возможное для рассеянного света (1,0). Фактически, если измеренная анизотропия для случайно ориентированного образца больше чем 0,4, можно уверенно сделать вывод о присутствии рассеянного света в дополнение к флуоресценции. Максимальное значение анизотропии 0,4 для параллельных диполей поглощения и испускания является следствием того, что вероятность поглощения света равна сов 0. [c.130]

В стеклообразном растворе, таком, как пропиленгликояь при -70°С, флуорофоры остаются неподвижными в течение времени нахождения в воз-, бужденном состоянии. В этих условиях измерение значения анизотропии Tq позволяет определить угол между диполями поглощения и испускания [ уравнение (5.20)). Так как ориентация диполей поглощения различна для каждой полосы поглощения, то угол а меняется с длиной волны. Следовательно, Гц также должна варьироваться с изменением длины волны возбуждения, Спектр поляризации - это график зависимости поляризации или анизотропии флуоресценции от длины волны для флуорофора в вязком растворе. Для получения истинного спектра поляризации необходимо использовать [c.131]

Пусть / (i) отображает кинетику затухания 0бн10Й интенсивности флуоресценции [/ (г) +2 (i)]. Стационарное измерение анизотропии является в действительности усреднением r t) с весом l t). Таким образом, [c.145]

Измерение поляризации флуоресценции или анизотропии широко используется для количественной оценки реащий ассоциации биологических макромолекул. Связывание антигена с анти 11елом [21], ассоциация белков [22], ассоциации лигандов с белками и нуклеиновыми кислотами [23, 24] — вот только несколько примеров. Предположим, что флуорофор может находиться либо в свободном виде, либо может быть связан с макромолекулой. Наблюдаемое значение анизотропии флуоресценции, когда присутствуют обе формы, дается выражением [c.156]

При к = 1 это выражение сводится к уравнению (5.57). Если же при связывании происходят значительные изменения в квантовом выходе, то их можно использовать для количественной характеристики реакции ассоциации. Когда изменения малы (в два раза или меньше), предпочтительнее использование анизотропии, особенно если при связывании сильно меняется г. Волее того,измерения анизотропии не зависят от общей интенсивности флуоресценции, благодаря чему можно использовать шшзотронию и т( х случаях, когда трудно измерить интеисивность из-за свойств образца или особенностей прибора. [c.158]

Кинетика затухания анизотропии флуоресценции измеряется при импуль сном возбуждении, как это описано при обсуждении измерений времон затухания (гл. 3). Для отбора необходимой поляризоваппой составляющей возбуж- [c.163]

Разностная поляризационно-фазовая флуорометрия (РПФ) представляет собой один из методов изучения кинетик затухания анизотропии. В этом методе образцы возбуждают поляризованным синусоидально-модулированным светом и измеряют разность фаз (Л = — фц ) между перпендикулярной и параллельной компонентами испускания. Эта разность фаз зависит от г , частоты модуляции, скорости вращения флуорофора, свободы и изотропности вращений. Следовательно, можно получить информацию о виде r t). Как и в случае измерения времен затухания флуоресценции фазовым методом (гл.З), получают косвенную информацию, особенно когда измерения проводят с использованием одной частоты модуляции. И тем не менее, в этих измерениях содержится ценная информация об анизотропии [ 22, 23] и затрудненности вращений [24] и могут быть измерены скорости быстрых вращений [ 25].. [c.180]

В предыдущих разделах были описаны инструментальные средства для получения информации о кинетике затухания анизотропии. Такую информацию можно получить, не проводя временных измерений, если существует метод, в котором время затухания флуоресценции можно варьировать [35, 36].. Тушение флуоресценции при столкновениях дает именно такую возможность (гл. 9). Пелый ряд молекул действуют как тушители при столкновении, например молекулярный кислород. В присутствии кислорода время затухания флуоресценции т равно [c.188]

Энциклопедия по машиностроению XXL

Оборудование, материаловедение, механика и ...