Возбуждение флуорофоров

За поглощением света обычно следует несколько других процессов. Возбуждение флуорофора, как правило, происходит до некоторого высшего колебательного уровня состояний (51 либо 8 ).3в некоторыми редкими исключениями, для молекул в конденсированной фазе характерна быстрая релаксация на самый нижний колебательный уровень состояния 5 . Этот процесс называется внутренней конверсией и происходит большей частью за 10 с. Поскольку типичные времена затухания флуоресценции близки к 10 с, внутренняя конверсия обычно полностью заканчивается до процесса испускания. Следовательно, испускание флуоресценции чаще всего осуществляется из термически равновесного возбужденного состояния. Аналогично поглощению обратный переход электронов на самый нижний электронный уровень также приводит к колебательно возбужденному состоянию (рис. 1.3). Термическое равновесие достигается за время порядка [c.14]

Количественному изучению спектральных сдвигов посвящено множество исследований, что вполне можно понять, поскольку спектр испускания легко измеряется. Однако часто возникают обратные задачи. Например, что можно сказать на основе спектра испускания флуорофора, связанного с макромолекулой, о природе места его присоединения Является ли оно полярным, неполярным или средней полярности Доступно ли оно для воды или находится внутри белка или мембраны Жестко ли оно во временной шкале испускания флуоресценции или подвижно и чувствительно к возбуждению флуорофора [c.200]

Время ЖИЗНИ возбужденного состояния определяется как среднее время, в течение которого молекула находилась в возбужденном состоянии до того, как вернуться в основное состояние. Обычно время затухания флуоресценции 10 ПС. Для флуорофора, описываемого диаграммой Яблонского (рис. 1.8), время затухания равно [c.20]

В противоположность этому параметры флуоресцентной спектроскопии являются чувствительными функциями всех процессов, протекающих за время жизни возбужденного состояния, причем в этих процессах могут участвовать молекулы, находящиеся в момент возбуждения на расстояниях до 100 А от флуорофора. Хотя может показаться, что 10 пс - слишком короткий промежуток времени, фактически это большое время по сравнению с вре- [c.22]

Рассмотрим возбуждение флуорофора бесконечно коротким импульсом света, приводящее к первоначальной заселенности возбужденного состояния флуорофоров (Л о). Скорость гибели первоначально возбужденных молекул [c.61]

В реальных экспериментах возбуждение будет направлено вдоль оси х. При этом с одинаковой вероятностью должны возбудиться все молекулы, имеющие равные углы 9, т.е. популяция возбужденных флуорофоров будет симметрично распределена вокруг оси z. Любая экспериментально доступная популяция молекул будет ориентирована так, что угол ф будет принимать значения от О до 2тг с равной вероятностью. Следовательно, мы можем исключить зависимость от ф в уравнении (5.11). Среднее значение опро деляется выражением [c.128]

ПРИЛОЖЕНИЯ УРАВНЕНИЯ ЛИППЕРТА. Уравнение Липперта - общее выражение, описывающее стоксов сдвиг, который можно ожидать для данного флуорофора в средах различной полярности. Можно полагать, что чувствительность флуорофора к полярности растворителя будет пропорциональна (и - м) Ожидается, что этот член постоянен для данного флуорофора и, следовательно, можно построить градуировочные кривые зависимости (Уд - V ) от А/. Если теперь флуорофор поместить в неизвестное окружение, полярность этого окружения можно рассчитать, зная (v - v ). И наоборот, влияние на стоксов сдвиг величины А/ можно использовать для оценки изменения дипольного момента при возбуждении. Флуорофоры, дипольный момент которых сильнее меняется при возбуждении, должны быть более чувствительны к полярности растворителя. [c.206]

Уравнение Штерна - Фольмера может быть выведено несколькими способами. Прежде всего рассмотрим интенсивность флуоресценции в отсут ст-вие и в присутствии тушителя. Интенсивность флуоресценции, наблюдаемая для флуорофора, пропорциональна его концентрации в возбужденном состоянии При непрерывном облучении устанавливается стационарная концентрация возбужденных флуорофоров и, следовательно, [Р ] / г = 0. В отсутствие и в присутствии тушителя дифференциальные уравнения, описывающие Р представляются в виде [c.266]

Это уравнение можсуг быть также выведено путем рассмотрения доли возбужденных флуорофоров, дезактивирующихся путем излучения, по отношению к общему числу возбужд(Нпп>1Х флуорофоров. Доля Р /Р определяется отношением скорос Л и затухания Г флуоресценции к общей скорости затухания в присутствии тушителя (Г А [ (21) [c.267]

Модель для обратимой реакции с участием двух состояний возбужденного флуорофора приведена на рис. 12.1. Обозначения уровней энергии и соответствующие индексы Р и Я относятся к первоначально возбужденному и образовавшемуся в результате реакции состояниям соответственно. Константы скорости дезактивации отих состояний ргшны Л + и Г = где и [c.391]

Измерение спектров и анизотропии флуоресценции в стационарном, импульсном и модуляционном режимах позволяет в настоящее время изучать широкий спектр структурных и динамических свойств молекулярных систем локализацию и доступность флуорофоров в макромолекулах, мембранах и других микрогетерогенных системах, их организацию и структуру, проницаемость, коэффициенты распределения и сегрегацию веществ в таких системах, микровязкость, вращательную диффузию и сегментальную подвижность, заторможенное и ограниченное вращение групп, процессы релаксации, димеризации, связывания, ассоциации и денатурации. Изучая релаксацию спектров и анизотропию флуоресценции, можно получить информацию о ближайшем окружении флуорофора (1-2 молекулярных слоя) изучая перенос энергии, тушение и реакции возбужденных молекул, можно зондировать уже больший объем вокруг флуорофора (до 10 нм). Как это сделать практически, можно научиться по книге Дж. Р. Лаковича. Конечно, данная область находится лишь в начале своего развития. Многие возможности пока ещё не реализованы, многие трудности и ограничения пока не до конца осозна11Ы, иногда появляется излишний оптимизм и делаются довольно смелые выводы. Со временем все эти трудности роста при широком применении флуоресцентных методов будут преодолены. Безусловно, можно надеяться, что именно флуоресцентные методы позволят получить более глубокую информацию о структуре и свойствах организованных молекулярных систем - как природных, так и синтетиче ских, - научиться управлять ими и создавать эффективные системы для преобразования солнечной энергии в химическую, записи и обработки информации, молекулярной электроники. [c.6]

Люминесценция - испускание фотонов из электронно-возбужденных состояний - делится на два типа в зависимости от природы основного и возбужденного состояний. В синглетном возбужденном состоянии электрон на энергетически более высокой орбитали и второй электрон на орбитали с более низкой энергией имеют противоположную ориентацию спинов. Говорят, что эти электроны спарены. В триплетном состоянии эти электроны не спарены, т.е. их спины имеют одинаковую ориентацию. При возвращении электрона из возбужденного синглетного состояния в основное ориентация его спина не должна меняться. Изменение ориентации спина необходимо при переходе из триплетного состояния в сииглетное основное состояние. Флуоресценция - это испускание, происходящее при возвращении спаренного электрона на более низкую орбиталь. Такие переходы квантовомеханически разрешены", а типичные величины скоростей испускания для них 10 с Ч Высокие значения скоростей испускания приводят к временам затухания флуоресценции 10-в с (10 нс). Время жизни -г это средний период времени, в течение которого флуорофор находится в возбужденном состоя-нии.Фосфоресценция- это испускание, происходящее при переходе между состояниями различной мультиплетности , как правило из возбужденного триплетного состояния в синглетное основное. Такие переходы не разрешены, и константы скорости испускания малы. Типичный диапазон времени затухания фосфоресценции - )т миллисекунд до секунд, что главным образом зависит от вклада других процессов дезактивации. В данной книге повсюду мы в первую очередь будем рассматривать более быстрый процесс флуоресценции. [c.10]

Необходимо помнить, что испускание флуоресценции - это случайный процесс и не все молекулы испускают фотоны при < = т. Время жизни - это средняя продолжительность пребы аиия в возбужденном состоянии. В примере для одноэкспоненциального затухания, приведенном в гл. 3 ,63% молекул гибнет за время = т, а 37 % - за время t > т. Время жизни флуорофора в отсутствие безызлучательных процессов, называемое собственным временем жизни, [c.20]

При возбуждении поляризованным светом селективио возбуждаются те молекулы флуорофора, для которых дипольный момент перехода при поглощении параллелен электрическому вектору возбуждающего света (см. разд. 5.2.1). [c.21]

Тушение флуоресценции молекулярным кислородом по механизму столкновений является показательным примером размеров пространственного и временного диапазонов, представляемых временем затухания флуоресценции. Если флуорофор, находящийся в возбужденном состоянии, сталкивается с молекулой кислорода, он возвращается в основное состояние без испускания фотона. Коэффициент диффузии кислорода в воде при 25°С равен 2,5 10 см /с. Среднее расстояние [ (Ах ) З, на которое может диффун-дир()1 ать молекула кислорода за 10- с, определяется уравнением Эйнштейна [c.23]

Видно, что знаменатель равен т. Интегрируя числитель по частям, находим, что он равен т . Следовательно, для экспоненциальной гибели среднее время, в течение которого флуорофор находится в возбужденном состоянии, равно его времени жизни [c.63]

Легко показать, каким образом можно получить такие спектры, используя стробоскопический метод. Интенсивность флуоресценции можно измерять через любой желаемый промежуток времени, прошедший после возбуждения (см рис. 3.5). Вместо обычного способа варьирования временной задержки еи фиксируют и а каком-то определенном значении. Тогда испускание наблюдают через монохроматор, как обычно, сканируя по длинам воли Типичные спектры для 4-аминофталимида показаны па рис. 8 11. При температурах, использованных в этих исследованиях, время релаксации растворителя сравнимо с временем затухания. Через меньшие промежутки времени после импульса возбуждения наблюдается сдвинутый в коротковолновую область спектр, который соответствует нерелаксировашюму состоянию флуорофора. При больших временах испускание сдвигается в сторону больших длин оолн, что указывает на процесс релаксации. [c.83]

Интересно также сравнить метод ФЧРФ с другим, импульсным методом получения мгновенных спектров испускания (МСИ) [ 5, б]. При использовании МСИ образец возбуждают коротким импульсом света, затем записывают спектры через определенные заданные промежутки времени после момента возбуждения. Техника мгновенных спектров флуоресценции обладает огромными потенциальными возможностями и имеет большое практическое значение, и мы здесь не будем сравнивать эти методы. Однако одно преимущество метода ФЧРФ заслуживает упоминания. В методе МСИ в любой момент времени оба флуорофора дают вклад в испускание. Можно выбрать некоторый интервал времени для частичного выделения флуоресценции любого из флуорофоров, но с помощью такой методики полностью провести разделение [c.118]

Если возбуждение поляризоЕГсДЮ вдоль оси 2, то оно симметрично по отношению к X и у. Как результат, дипольиое излучении флуорофора также симметрично по оси г. Следовательно, 1 . Учитывая, что /у = и 5г / , получаем уравнение (5.2). [c.125]

В стеклообразном растворе, таком, как пропиленгликояь при -70°С, флуорофоры остаются неподвижными в течение времени нахождения в воз-, бужденном состоянии. В этих условиях измерение значения анизотропии Tq позволяет определить угол между диполями поглощения и испускания [ уравнение (5.20)). Так как ориентация диполей поглощения различна для каждой полосы поглощения, то угол а меняется с длиной волны. Следовательно, Гц также должна варьироваться с изменением длины волны возбуждения, Спектр поляризации - это график зависимости поляризации или анизотропии флуоресценции от длины волны для флуорофора в вязком растворе. Для получения истинного спектра поляризации необходимо использовать [c.131]

Энциклопедия по машиностроению XXL

Оборудование, материаловедение, механика и ...