ПОИСК Статьи Чертежи Таблицы Монохроматоры из "Основы флуоресцентной спектроскопии " Монохроматизация светового потока в большинстве спектрофлуориметров осуществляется не с помощью призм, а дифракционными решетками. [c.36] Эффективности решеток с максимальным блеском при 300, 500 и 1000 нм. [c.37] В качестве другого примера для иллюстрации этого факта на рис. 2.7 приведен спектр испускания Н-ацетил-Ь-триптофанамида (NATA). Это соединение является производным триптофана, и его можно рассматривать для иллюстрации спектров испускания, ожидаемых для белков (гл. 11). Возбуждающий свет поляризован вертикально, а спектр испускания записан с поляризатором, ориентированным вертикально (В) и горизонтально (Г). Эти спектры явно различаются. Как и ожидалось, спектр, наблюдаемый через вертикально ориентированный поляризатор, сдвинут в коротковолновую область по сравнению со спектром, наблюдаемым при горизонтальной ориентации поляризатора испускания. Дополнительный пик при 390 нм обусловлен только пропускающей способностью монохроматора. Полученные результаты свидетельствуют о том, что можно сравнивать только те спектры, которые записаны в одинаковых условиях, в том числе и при одинаковой ориентации поляризаторов. Важно помнить, что если поляризация флуоресценции образца меняется, например вследствие изменения вязкости, то наблюдаемый спектр испускания может быть другим из-за зависимости эффективности пропускания от длины волны и от поляризации. Более того, вязкость и сама по себе может влиять на спектр испускания. [c.38] Буфер — 0,1 М раствор фосфата натрия, pH 7,5 25° С,.Длина волны возбуждения 280 нм. Ширина полос возбуждения и флуоресценции 8 и 4 нм соответственно. Условия поляризации относятся к ориентации поляризаторов возбуждения и испускания (В — вертикальная, Г -- горизонтальная). Образец содержал небольшие количества гликогена (для рассеяния света). [c.39] Можно обойти эту проблему, используя для измерения П-фактора различные длины волн возбуждения, поскольку С-фактор - это характеристика монохроматора испускания, а не длины волны возбуждения. Эта точка зрения может быть проиллюстрирована следующим примером. При изм1 [)1чши поляризации флуоресценции белка (340 нм) часто используют длину волны возбуждения 300 нм. Бри этой длине волны свет, выходящий из монохроматора возбуждения, почти полностью поляризован в вертикальном направлении, в результате чего интенсивность излучения в горизонтальном направлении недостаточна для измерения С-фактора. Поэтому для измерения нужно использовать несколько различных длин волн возбуждения, обычно 280, 285, 290 и 295 нм, и затем усреднить величину О-фактора. На практике эти величины почти одинаковы, но усреднение повышает точность определения. [c.40] Во всех экспериментах по измерению флуоресценции важно исследовать контрольные образцы, которые во всем идентичны исследуемым образцам, но не содержат флуорофора ( холостой опыт). Такие образцы позволяют оценивать рэлеевское и комбинационное рассеяние и устранять их влияние. [c.41] Голографические решетки устраняют рассеяшый свет лучше, чем линованные. Ясно, что большое значение имеют дефекты решеток, приводящие к побочным изображениям, которые могут выходить из монохроматоров. [c.42] В случае использования голографических решеток таких изображений меньше, поскольку эти решетки совершеннее. Кроме того, в монохроматорах с голографическими решетками меньше отражающих поверхностей. Это связано с тем, что решетка может также работать как линза, и для фокусировки не требуется больших вогнутых зеркал. При меньшем числе отражающих поверхностей вероятность прохождения рассеянного света через монохроматор уменьшается. [c.42] ГРАДУИРОВКА МОНОХРОМАТОРОВ. Градуировку монохроматоров по длинам волн надо проводить регулярно, особенно для тех монохроматоров, где градуировку осуществляют с помощью электроники, а не путем прямого механического соединения. Для градуировки применяют ртутные пальчиковые лампы. Ртутную лампу низкого давления изготавливают в форме цилиндра диаметром 5 мм. Такие лампы хорошо входят в кюветное отделение. Для того, чтобы стационарно установить лампу, используют метал-лИ ческий блок, в который плотно входит лампа. Этот держатель имеет те же размеры, что и кювета. На одной из его сторон есть диафрагма, которая позволяет ограничивать световой поток, попадающий в монохроматор испускания. Для того чтобы повысить точность определения длины волны и уменьшить интенсивность света, устанавливают небольшую ширину щели. Важно ослабить световой поток, чтобы не повредить фотоумножитель и/или усилитель. После выполнения указанных предосторожностей устанавливают наиболее сильные ртутные линии, используя монохроматор испускания. Измеренные длины волн сравнивают с известными величинами, которые приведены в табл. 2.1. Если наблюдаемые значения отличаются от табличных на постоянную величину, градуируют монохроматор еще раз до получения совпадения. Более серьезные проблемы возникают, если шкала длин волн нелинейна, т. е. измеренные длины воли отличаются от приведенных в таблице на величину, которая зависит от длины волны. В этом случае монохроматор обычно возвращают изготовителю для переделки. [c.42] Вернуться к основной статье