ПОИСК Статьи Чертежи Таблицы Фазово-контрастные и интерференционные методы в микроскопии из "Лабораторные оптические приборы Издание 2 " Описанные методы могут быть полезными для изучения таких объектов, которые выделяются на фоне всего поля зрения вследствие своей способности иначе поглощать свет, чем окружающая среда (абсорбционные структуры). В микроскопии очень распространено также наблюдение объектов, отличающихся от окружающей среды главным образом по своему показателю преломления (рефракционные структуры). [c.24] Рефракционные структуры вносят изменения не в амплитуду, а в фазу проходящей волны. Однако такие структуры не могут быть непосредственно рассмотрены или сфотографированы, ибо наши приемники реагируют не на фазу, а на амплитуду (интенсивность), которая остается неизменной при прохождении света через разные участки рефракционной структуры. Иначе говоря, в микроскопии часто приходится иметь дело с препаратами, которые невидимы не потому, что они слишком малы, а единственно потому, что они малоконтрастны. Таковы, например, некоторые бактерии, не имеющие и следов окраски и такие же прозрачные, как и жидкость, в которую они погружены. Эти малые объекты отличаются от окружающей среды только небольшим различием в показателе преломления. [c.25] Ранее для наблюдения таких объектов применяли дифференциальное окрашивание препаратов, после чего малоконтрастные прозрачные объекты превращаются в поглощающие (контрастные) или разноцветные. Но, во-первых, далеко не все детали объектов могут быть окрашены в разные цвета во-вторых, дифференциальное окрашивание малопригодно при изучении живых объектов. Используя наличие разности в показателях преломления объекта и среды, голландский физик Цернике (1935 г.) разработал новый метод — метод фазового контраста, который позволил сделать видимыми такие прозрачные объекты, как описанные выше [35]. Метод фазового контраста основан на том, что фаза световых колебаний нулевого спектрального максимума (т. е. прямо прошедшего света), как показывает анализ, отличается от фазы колебаний спектра первого порядка (т. е. света, дифрагированного объектом) на я/2. [c.25] Около коллектора 2 расположена ирисовая полевая диафрагма 3, расстояние которой от конденсора таково, что он дает на объекте действительное изображение диафрагмы 3. Микроскоп состоит из объектива 6 и окуляра 7. Схема освещения представляет описанную выше схему Келера. [c.26] Рассмотрим в качестве примера прозрачную бактерию А и предположим, что лампа 1 является монохроматическим источником света. Бактерия дифрагирует падающий свет в конус, угол при вершине которого тем больше, чем меньше размер бактерии. На рис. 1.16 заштрихованная область показывает ту часть дифрагированного света, которая попадает в микроскоп. [c.26] Уменьшим отверстие диафрагмы 4 так, чтобы использовалась только небольшая часть изображения источника 1 в точке F. Изображение F точки F получается в фокальной плоскости л объектива 6. Изображение F тоже мало, и можно считать, что в плоскости я пучок прямого света, посылаемого лампой 1, полностью отделяется от пучка, дифрагированного бактерией. В этой плоскости прямой световой пучок освещает лишь очень малую область, тогда как пучок дифрагированного света охватывает большую часть плоскости. [c.26] Рассмотрим область, где находится бактерия А. Пусть об и п р — показатели преломления бактерии и среды (рис. 1.17). Если показатель преломления n f, немного больше то свет, проходящий через бактерию (луч /), несколько запаздывает по отношению к свету, проходящему через среду мимо бактерии (луч 2). Монохроматические световые колебания могут быть представлены синусоидальными колебаниями типа у = а sin х, где у — смещение при колебании а — амплитуда, ах — абсцисса колеблющейся точки. [c.26] На рис. 1.18 синусоида 2 представляет собой световое колебание, распространяющееся по пути луча 2 (см. рис. 1.17). Световое колебание, проходящее через бактерию, немного запаздывает по отношению к предыдущему. Оно изображено синусоидой 3 (рис. 1.18), тождественной синусоиде 2, но сдвинутой по оси х. и две синусоиды фактически идентичны, так как бактерия невидима вследствие недостаточного контраста. Другими словами, интенсивность света одинакова по всему полю. Интенсивность света пропорциональна квадрату амплитуды а , и все колебания, проходящие через препарат, имеют одинаковую амплитуду, в частности и колебания 3 и 2. Но между этими колебаниями имеется небольшая разность фаз. Синусоиду 3 можно рассматривать как сумму двух синусоид — синусоиды 2 и синусоиды 1, сдвинутой на л/2 (разность фаз л/2) по отношению к предыдущей и с очень малой амплитудой ОМ. [c.27] Из рисунка видно, что при суммировании ординат кривых 2 и 1 вновь получается синусоида 3. [c.27] Можно сказать, что синусоида 1 соответствует колебаниям, дифрагированным бактерией. Ее амплитуда ОМ тем меньше, чем меньше — ср- Если (Моб — ср) - О, то и сдвиг синусоид будет стремиться к нулю и синусоида 1 исчезнет, т. е. дифрагированных колебаний не будет. Что касается синусоиды 2, то она представляет собой колебания, непосредственно участвующие в образовании изображения F. [c.27] В плоскости я колебание, соответствующее изображению F, называется прямым, а второе колебание соответствует дифрагированному свету, который распределяется вокруг F и сдвинут по фазе на я/2 по отношению к первому. [c.27] Изображение бактерии получается в результате сложения всегда сдвинутых по фазе на я/2 колебаний 2 и 1, которые приходят в А (см. рис. 1.16). Интенсивность света в изображении А бактерии определяется суммой квадратов составляющих амплитуд 2 и /. [c.27] Допустим, что нам удалось с помощью соответствующего приспособления сдвинуть кривую 1 еще на я/2 относительно кривой 2. Относительное расположение колебаний 2 и 7, которые прошли через бактерию и пришли в ее изображение, будет соответствовать либо рис. 1.19, а, либо рис. 1.19, б. [c.27] Получилось, что интенсивность 1 изображения бактерии отличается от интенсивности 1 остального поля, и бактерия становится видимой. [c.28] И здесь 1[ отличается от /г, и бактерия снова видна. [c.28] В первом случае (рис. 1.19, а) 1 , и бактерия кажется более светлой, чем остальное поле (негативный контраст) во втором случае (рис. 1.19, б) /i /2, и бактерия кажется более темной (позитивный контраст). [c.28] Таким образом, дополнительное смещение кривой 1 на л/2 по отношению к ее первоначальному положению, т. е. фазовый сдвиг на л/2 прямых колебаний относительно дифрагированных, позволяет превратить незначительную разность фаз в объекте (разность показателей преломления или толщин) в разность интенсивностей света в изображении. В этом и заключается сущность метода фазового контраста. [c.28] Задача дополнительного сдвига фазы между прямыми и дифрагированными колебаниями может быть решена установкой в задней фокальной плоскости объектива микроскопа л-прозрачной пластинки, настолько маленькой, чтобы через нее проходил только прямой свет от источника, а проходящим через нее дифрагированным светом можно пренебречь. [c.28] Изменением толщины фазовой пластинки можно добиться повышения контраста изображения, так как практически мы будем изменять амплитуду только прямого света. [c.29] С фазовой пластинкой с 50-кратным ослаблением света достигается максимальный контраст. [c.29] Вернуться к основной статье